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裂谷熱病毒ELISA檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

廣州健侖生物科技有限公司

裂谷熱（RVF）是由裂谷熱病毒引起的，經(jīng)蚊類媒介或接觸傳播的急性病毒性人畜共患病，主要影響的是動(dòng)物，但也能傳染人。初始的癥狀有：發(fā)熱、頭痛、疲勞、關(guān)節(jié)和肌肉疼痛，有時(shí)會(huì)有惡心、嘔吐，部分患者會(huì)出現(xiàn)結(jié)膜炎及畏光的現(xiàn)象；嚴(yán)重者可能會(huì)導(dǎo)致出血、休克、腦炎或肝炎，甚至是死亡。

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（2）著絲粒（centromere，CEN）：有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC中起到保證一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)人工染色體的作用。如pYAC4使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。

（3）自主復(fù)制序列（autonomously replication sequences，ARS）：一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必須的信號(hào)。

（4）標(biāo)記基因。YAC載體的選擇標(biāo)記主要采用營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等，以及赭石突變抑制基因sup4。與YAC載體配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因帶有一個(gè)赭石突變ade 2-1。帶有這個(gè)突變的酵母菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上形成紅色菌落，當(dāng)帶有赭石突變抑制基因sup4的載體存在于細(xì)胞中時(shí)，可抑制ade 2-1基因的突變效應(yīng)，形成正常的白色菌落。利用這一菌落顏色轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，可用于篩選載體中含有外源DNA片段插入的重組子。

三、YAC載體的工作原理

YAC 在結(jié)構(gòu)上能模擬酵母染色體的線狀DNA分子。將大片段的基因組DNA連接到Y(jié)AC載體的兩個(gè)“臂”上，然后將連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入酵母菌，這樣就構(gòu)成了重組的YAC。每一條臂分子中都攜帶一個(gè)選擇標(biāo)記以及按適當(dāng)方向排列的起端粒作用的DNA序列。另外，其中一條臂上還攜帶著絲粒DNA序列以及復(fù)制子序列。因此在重組的YAC中，外源基因組DNA片段的一側(cè)為著絲粒、復(fù)制子及選擇標(biāo)記，另一側(cè)為第二種選擇標(biāo)記。通過在選擇性瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落可鑒定出已轉(zhuǎn)化并穩(wěn)定保持人工染色體的酵母轉(zhuǎn)化子。

在 YAC載體中常用的是pYAC4。由于酵母的染色體是線狀的，因此其在工作狀態(tài)也是線狀的。但是，為了方便制備YAC載體，YAC載體以環(huán)狀的方式存在，并增加了普通大腸桿菌質(zhì)粒載體的復(fù)制元件和選擇標(biāo)記，以便保存和增殖。

YAC載體主要是用來構(gòu)建大片段DNA文庫，特別用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。下圖是以pYAC4為例如，當(dāng)用BamHI切割成線狀后，就形成了一個(gè)微型酵母染色體，包含染色體復(fù)制的必要順式元件，如自主復(fù)制序列、著絲粒和位于兩端的端粒。對(duì)于BamHI切割后形成的微型酵母染色體，當(dāng)用EcoRI或SmaI切割抑制基因sup4內(nèi)部的位點(diǎn)后形成染色體的兩條臂，與外源大片段DNA在該切點(diǎn)相連就形成一個(gè)大型人工酵母染色體，通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入到酵母菌后可象染色體一樣復(fù)制，并隨細(xì)胞分裂分配到子細(xì)胞中去，達(dá)到克隆大片段DNA的目的。

酵母人工染色體（yeast artificial chromosome，YAC）

裝載了外源DNA片段的重組子導(dǎo)致抑制基因sup4插入失活，從而形成紅色菌落；而載體自身連接后轉(zhuǎn)入到酵母細(xì)胞后形成白色菌落。這些紅色的裝載了不同外源DNA片段的重組酵母菌菌落的群體就構(gòu)成了YAC文庫。

四、YA載體的優(yōu)缺點(diǎn)

YAC載體雖然功能強(qiáng)大，但有一些缺點(diǎn)，主要表現(xiàn)在3 個(gè)方面：

（1）在YAC載體的插入片段會(huì)出現(xiàn)缺失（deletion）和基因重排（rearrangement）現(xiàn)象。

（2）容易形成嵌合體。嵌合就是在單個(gè)YAC中的插入片段由2個(gè)或多個(gè)的獨(dú)立基因組片段連接組成。嵌合克隆約占總克隆的5-50%。

（3）YAC染色體與宿主細(xì)胞的染色體大小相近，影響了YAC載體的廣泛應(yīng)用。YAC染色體一旦進(jìn)入釀酒酵母細(xì)胞，由于其大小與內(nèi)源的染色體的大小相近，就很難從中分離出來，不利于進(jìn)一步分析。

但是YAC載體也具有一些突出的優(yōu)點(diǎn)：